- Маркеры опухолевого роста и их выявление.
- Основы ранней молекулярной диагностики злокачественных опухолей.
- Выявление опухолевых клеток в костном мозге.
- Выявление опухолевых клеток в периферической крови.
- Выявление опухолевых клеток в лимфатических узлах.
Достижения молекулярной онкологии позволяют рассматривать онкологическое заболевание как болезнь, которая характеризуется клональной эволюцией трансформированных клеток в том или ином органе или ткани. Известно, что раковые клетки возникают вследствие накопления мутаций в критических протоонкогенах и ассоциированных с опухолями генах-супрессорах. На основании этого логично предположить, что раннее выявление опухолевого зачатка возможно, хотя и сложно методически. Обнаружить опухоль на ранних стадиях ее развития можно при исследовании крови, мочи, ряда биологических жидкостей, в которых могут быть обнаружены те или иные биомолекулы, являющиеся продуктами жизнедеятельности развивающейся опухоли или результатом реакции различных систем организма на появившиеся опухолевые клетки.
Есть и другой аспект проблемы, который связан с ранним распознаванием метастазов. Наличие минимальной остаточной опухоли и микрометастазов существенно ограничивает перспективу дальнейшего увеличения показателей выживаемости. До последнего времени поиск микрометастазов осуществляли только традиционными методами световой микроскопии, которые в большинстве случаев оказываются неэффективными. Развитие иммуноцитохимических и молекулярно-биологических технологий сделало возможной идентификацию единичных изолированных опухолевых клеток в лимфатических узлах, серозных жидкостях организма, периферической крови и костном мозге. В частности, удается выявить одну опухолевую клетку среди 1000000 разнообразных по своей природе кроветворных клеток костного мозга. Современная диагностика опухолей предусматривает обязательное применение наряду с классическими морфологическими методами иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов.
Маркеры опухолевого роста и их выявление.
Существует три группы маркеров опухолевого роста, которые ассоциированы с белками, РНК и ДНК. Белок-ассоциированные маркеры могут определяться в обычных пробах крови рутинными биохимическими и иммунохимическими методами. Среди таких маркеров следует упомянуть простатоспецифический антиген (ПСА) при раке предстательной железы, СА 125 при раке яичника, раково-эмбриональный антиген (РЭА) при карциномах органов пищеварительного тракта, человеческий хорионический гонадотропин при трофобластических опухолях, альфа-фетопротеин при гепатоцеллюлярном раке и эмбриональных карциномах. Выявление этих белков важно для определения прогноза и мониторинга заболевания, раннего обнаружения метастазов и рецидивов опухоли. Однако их применение ограничено, так как они недостаточно специфичны для какой-либо одной опухоли или типа опухолей, а их присутствие в крови часто указывает на уже распространенный процесс. Использование маркеров, ассоциированных с РНК, основано на наличии мутаций в протоонкогенах и генах-супрессорах опухолей, которые могут определяться и в транскриптах. РНК - менее подходящий субстрат для клинической диагностики опухолей, чем ДНК, так как она легко деградирует, но оценка экспрессии на уровне РНК все же осуществима. Современные методы позволяют определять экспрессию тех или иных мутантных генов, в частности путем выделения их РНК-продуктов из клинического материала с последующей обратной транскрипцией (ОТ) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) для амплификации ДНК (ОТ-ПЦР). Этот метод дает возможность определять экспрессию генов в клетках крови, лимфатических узлов и костного мозга. Анализ цельной крови и костного мозга на наличие анормальных транскриптов, полученных из трансформированных клеток, применяют для мониторинга больных с хроническим миелолейкозом, минимальной резидуальной болезнью. Наиболее перспективно использование этого метода для обнаружения микрометастазов - единичных опухолевых клеток в тканях.
ДНК - идеальный субстрат для молекулярной диагностики, так как она весьма стабильна и может быть быстро амплифицирована с помощью техники ПЦР, что дает возможность обойтись минимальным количеством клеточного материала. Удалось обнаружить мутации гена р53 в ДНК, определяемой в моче больных раком мочевого пузыря, а также мутации онкогена Ras в ДНК обнаруженной в выделениях при колоректальном раке. Мутации обоих генов выявлены в ДНК, содержащейся в мокроте больных раком легкого.
Важное место в обнаружении опухолевых клеток занимает анализ последовательностей нуклеотидов микросателлитных повторов ДНК, который позволяет установить как наличие новой аллели гена (что свидетельствует о нестабильности микросателлитной ДНК), так и потерю одной из его аллелей (потерю гетерозиготности). Такие находки указывают на присутствие клеточных клонов, содержащих измененную генетическую информацию, что характерно для опухолевых клеток. "Микросателлитный анализ" применяли при исследовании мочи у больных раком мочевого пузыря и гипернефромой, слюны при опухолях головы и шеи, панкреатического сока при раке поджелудочной железы, изучении пункционных аспиратов при раке молочной железы, мокроты при раке легкого.
Несмотря на возможности, связанные с использованием перечисленных маркеров опухолевого роста, пока еще не существует абсолютно надежных методов ранней (досимптомной) диагностики опухолей. В преобладающем большинстве случаев врачам-онкологам приходится иметь дело с уже развившимися опухолями. И основными задачами являются морфологическое подтверждение диагноза, установление гистоструктуры и гистогенеза опухоли, определение степени ее злокачественности, выявление метастатического поражения регионарных и отдаленных лимфатических узлов, других органов, дифференциальная диагностика с иными патологическими процессами. Решая эти вопросы, используют материал, полученный при биопсии опухолей и лимфатических узлов, клетки крови, пунктаты костного мозга, экссудаты из серозных полостей, а также смывы и соскобы, сделанные во время оперативного вмешательства.
Основы ранней молекулярной диагностики злокачественных опухолей.
Основой диагностики злокачественных опухолей по материалам биопсий является изучение окрашенных обычными методами гистологических и цитологических препаратов. В то же время применение протокольной терапии диктует необходимость уточнять гистогенез опухолей, особенно низкодифференцированных, как можно раньше выявлять регионарные и отдаленные метастазы. Однако на основе исследования с использованием рутинных гистологических методов не всегда удается установить природу новообразования, уровень дифференцировки составляющих его клеток; бывает очень трудно обнаружить раковые клетки в лимфатических узлах и костном мозге, экссудатах из серозных полостей на ранних этапах метастазирования. Эти сложности удается преодолеть с помощью методов молекулярной биологии, иммуногисто- и иммуноцитохимии, которые базируются на достижениях биотехнологии и данных о молекулярных особенностях опухолевых клеток.
С этой целью стали применять иммуногистохимические методы с использованием моноклональных антител (МКАТ) к так называемым опухолеассоциированным антигенам. К последним условно можно отнести онкофетальные, тканеспецифические. органоспецифические антигены, белки промежуточных филаментов, ряд антигенов групп крови и гистосовместимости, ферменты, гормоны, белки, кодируемые онкогенами. Для их выявления на поверхностных мембранах и в цитоплазме клеток разработаны высокоспецифические и чувствительные методы иммуноферментного гистохимического анализа (РАР, АРААР, ABC, EnVision, LSAB и др.), которые могут применяться при изучении криостатных и парафиновых срезов, отпечатков, полученных при эксцизионной биопсии опухолей, мазков из тонкоигольных пунктатов лимфатических узлов и костного мозга, клеточных элементов спинномозговой жидкости и экссудатов из серозных полостей.
Пока еще нет точных тестов для определения стадии заболевания до операции. Отсутствуют также достоверные и доступные критерии для выявления больных с высоким риском развития метастазов после удаления первичной опухоли. В то же время установление распространенности опухолевого процесса до появления его клинических признаков имеет очень большое значение для правильного выбора тактики лечения. Наиболее часто используемый метод определения в сыворотке крови больных таких белков, как СА 19-9, СА 242, СА 125, СА 50, ПСА, РЭА, альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и ряд других, не удовлетворяет онкологов, так как содержание этих белков может быть повышено и при заболеваниях неопухолевой природы или при нарушении функции печени. Следует также помнить, что эти маркерные белки в основном обнаруживаются при уже развитом опухолевом процессе и не могут быть полезными для выявления раннего метастазирования или оценки его риска.
Благодаря достижениям иммуноцито- и иммуногистохимической, а также молекулярно-биологической техник сегодня можно выявлять так называемые микрометастазы (или оккультные метастазы) в лимфатических узлах, смывах из плевральной и брюшной полостей, в крови и костном мозге. Появляющиеся в литературе данные указывают на то, что применение МКАТ к белкам цитоскелета, ряду ткане- и органоспецифических и опухолеассоциированных антигенов позволяет находить опухолевые клетки в лимфоузлах и других биологических объектах с высокой степенью точности. Особый интерес представляют цитокератины - белки, которые являются неотъемлемыми составляющими частями цитоскелета нормальных и злокачественно трансформированных эпителиальных клеток. Применение МКАТ к цитокератинам, которые экспрессируются исключительно опухолями эпителиального происхождения, дает возможность идентифицировать единичные раковые клетки среди окружающих 100000-1000000 неопухолевых клеток лимфатического узла или костного мозга. И поэтому цитокератины можно рассматривать в качестве надежных маркеров клеток эпителиальной природы.
Не менее серьезной проблемой, от решения которой во многом зависят выбор правильного лечения больного со злокачественной опухолью и благоприятный исход заболевания, является обнаружение метастазов до их клинических проявлений. Современные диагностические методы, даже с учетом новейших технологий, не позволяют выявлять одиночные, диссеминированные опухолевые клетки. Для обозначения клеток, которые нельзя обнаружить с помощью обычных светооптических методов, в настоящее время довольно широко применяют термин "микрометастазы". Вместе с тем высказываются мнения о нецелесообразности использования этого термина или необходимости его коррекции. Следует обратить внимание на рекомендации отличать единичные раковые клетки от микрометастазов. Авторы считают, что микрометастазы - это образования из опухолевых клеток, наибольший размер которых не превышает 0,2 см. Циркулирующие (диссеминированные) опухолевые клетки, которые не формируют таких образований, предложено называть одиночными опухолевыми клетками, а их скопления - малыми кластерами. Одиночные опухолевые клетки не контактируют со стенками сосудов или лимфатических синусов и не пенетрируют их. При наличии таких клеток отсутствует внесосудистая (внесинусная) реакция элементов стромы. Микрометастазы же образуются тогда, когда происходят имплантация опухолевых клеток в том или ином органе или ткани и их пролиферация, что часто сопровождается соответствующей реакцией стромальных элементов.